3H－脯氨酸标记胶原蛋白的方法学建立
作者：佟巨慧 李 吉 吉 冯延民
单位：吉林省长春市(130041)白求恩医科大学口腔医学院
关键词：
口腔医学纵横990323 胶原蛋白广泛分布牙周组织，是牙周组织的主要组成成份。牙周病时，牙周组织中的胶原蛋白发生坏死变性和积累[1]。胶原酶是唯一一种首先分解胶原蛋白的酶[2]，其它任何酶对胶原蛋白不可进行一级分解[2]，牙周病的发生、发展及治疗效果均与胶原蛋白和胶原酶有着十分密切的关系[3]。为了研究牙周病的病因学、诊断学和预后，以及在治疗中的应用，建立核素标记的胶原蛋白是非常有价值的。核素方法有其灵敏度高、应用范围广和操作方便等特点[4]。近年来国外用14C-脯胺酸标记的胶原蛋白对牙周病的病因学进行了深入研究，并取得重大成果[5]。目前国外市场已推出这类核素标记的胶原蛋白，但价格昂贵，购之不便。因此，建立核素标记的胶原蛋白的方法是非常必要的，并有深远意义。
, 百拇医药
材料与方法
一、材料
1. 3H-脯氨酸：北京中国原子能研究院提供。
2. 胶原蛋白：本校地方病研究所生化室提供。
3. 碳化二亚胺：分析纯，中科院上海生化所东风生化技术公司提供。
4. 保温液：0.1M pH7.4PBS，0.1M pH8.0甘氨酸缓冲液，0.13M pH8.2硼酸缓冲液
5. β-计数仪：瑞典LKB公司产
二、方法
1. 偶联：将0.5ml(0.5mC)3H-脯氨酸溶液加入到1ml(1%)胶原溶酸液之中,再加入4mg碳化二亚胺在4℃下搅拌48h。其溶液在0.1MpH8.0甘氨酸缓冲液中透析12h(室温)，再以0.13MpH8.2硼酸缓冲液中透析12h(室温)，偶联完毕。
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2. 分离(过凝胶柱)：制备1cm×20cm玻璃柱，以Sephadex G-25为介质的凝胶层析柱。以0.1MpH7.4PBS为洗脱液待柱床平衡后，将偶联后的溶液上柱，0.3ml/d的速度洗脱，1ml/管收集20管，测每管的脉冲数。
结 果
以收集的管数为横座标，以放射脉冲数为纵座标(计算机结果)，绘制曲线如图1：
三次重复实验结果。
讨 论
从三次实验结果来看，3H-脯氨酸-胶原蛋白标记均成功。从第一峰与第二峰的面积来看，所给予的3H-脯氨酸的量较大，这是否影响标记率还需进一步探讨。从第一峰与第二峰两峰之谷来看，二峰间距太小，这可能由于胶原蛋白分子长而又不易弯曲，使得其分子难以通过如此之大孔的凝胶(球状体易于通过)造成二峰间距小的缘故。另外从标记率来看，其标记率低的主要原因很有可能是胶原蛋白分子结构的特点决定成的，三股α-螺旋肽链结构紧密，而且只有分子两端暴露-NH2与-COOH基团，尤其是-NH2基过少，导致标记率低的结果。但是，就被标的胶原蛋白来说，并不能说明每一分子(标记上与未标记上)之间标记率低,只能说明,3H-脯氨酸-胶原蛋白的利用率低。因此，可以说完全不影响3H-脯氨酸-胶原蛋白的应用。其次，实验过程中保温时间、工作温度等条件，是今后力求提高标记率的因素，获得最佳条件取得最佳标记率是今后的任务。
, 百拇医药
图1
注：第一峰为3H-脯氨酸-胶原蛋白，第二峰为3H-脯氨酸。
参考文献
1 Narayanan.Regulation of collagen production in fibroblasts cultrued from normal and phenytoin-induced hyperplastic human gingiva.JPeriodontal Res1988，23:118～121
2 李茂深编. 生物化学. 人民卫生出版社，1978，475～478
3 Sorsa T.Uitto V-J，Suomalainen K.Comparison of interstitial collagenese from human gingiva，Sulcular fluid and polymorphonuclear leukocytes. J Periodont Res 1988，23:386～393
4 李振甲，王仁芝主编. 激素放射免疫分析. 科学技术文献出版社，1985，14～15
5 Suomalainen K，Sorsa T，Saxen L,Collagenase activity in gingival crevicular fluid of patients with Juvenile periodontilis. Oral Microbiol Immunol 1991，6:24～29
[收稿：1998-10-12], http://www.100md.com
单位：吉林省长春市(130041)白求恩医科大学口腔医学院
关键词：
口腔医学纵横990323 胶原蛋白广泛分布牙周组织，是牙周组织的主要组成成份。牙周病时，牙周组织中的胶原蛋白发生坏死变性和积累[1]。胶原酶是唯一一种首先分解胶原蛋白的酶[2]，其它任何酶对胶原蛋白不可进行一级分解[2]，牙周病的发生、发展及治疗效果均与胶原蛋白和胶原酶有着十分密切的关系[3]。为了研究牙周病的病因学、诊断学和预后，以及在治疗中的应用，建立核素标记的胶原蛋白是非常有价值的。核素方法有其灵敏度高、应用范围广和操作方便等特点[4]。近年来国外用14C-脯胺酸标记的胶原蛋白对牙周病的病因学进行了深入研究，并取得重大成果[5]。目前国外市场已推出这类核素标记的胶原蛋白，但价格昂贵，购之不便。因此，建立核素标记的胶原蛋白的方法是非常必要的，并有深远意义。
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材料与方法
一、材料
1. 3H-脯氨酸：北京中国原子能研究院提供。
2. 胶原蛋白：本校地方病研究所生化室提供。
3. 碳化二亚胺：分析纯，中科院上海生化所东风生化技术公司提供。
4. 保温液：0.1M pH7.4PBS，0.1M pH8.0甘氨酸缓冲液，0.13M pH8.2硼酸缓冲液
5. β-计数仪：瑞典LKB公司产
二、方法
1. 偶联：将0.5ml(0.5mC)3H-脯氨酸溶液加入到1ml(1%)胶原溶酸液之中,再加入4mg碳化二亚胺在4℃下搅拌48h。其溶液在0.1MpH8.0甘氨酸缓冲液中透析12h(室温)，再以0.13MpH8.2硼酸缓冲液中透析12h(室温)，偶联完毕。
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2. 分离(过凝胶柱)：制备1cm×20cm玻璃柱，以Sephadex G-25为介质的凝胶层析柱。以0.1MpH7.4PBS为洗脱液待柱床平衡后，将偶联后的溶液上柱，0.3ml/d的速度洗脱，1ml/管收集20管，测每管的脉冲数。
结 果
以收集的管数为横座标，以放射脉冲数为纵座标(计算机结果)，绘制曲线如图1：
三次重复实验结果。
讨 论
从三次实验结果来看，3H-脯氨酸-胶原蛋白标记均成功。从第一峰与第二峰的面积来看，所给予的3H-脯氨酸的量较大，这是否影响标记率还需进一步探讨。从第一峰与第二峰两峰之谷来看，二峰间距太小，这可能由于胶原蛋白分子长而又不易弯曲，使得其分子难以通过如此之大孔的凝胶(球状体易于通过)造成二峰间距小的缘故。另外从标记率来看，其标记率低的主要原因很有可能是胶原蛋白分子结构的特点决定成的，三股α-螺旋肽链结构紧密，而且只有分子两端暴露-NH2与-COOH基团，尤其是-NH2基过少，导致标记率低的结果。但是，就被标的胶原蛋白来说，并不能说明每一分子(标记上与未标记上)之间标记率低,只能说明,3H-脯氨酸-胶原蛋白的利用率低。因此，可以说完全不影响3H-脯氨酸-胶原蛋白的应用。其次，实验过程中保温时间、工作温度等条件，是今后力求提高标记率的因素，获得最佳条件取得最佳标记率是今后的任务。
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图1
注：第一峰为3H-脯氨酸-胶原蛋白，第二峰为3H-脯氨酸。
参考文献
1 Narayanan.Regulation of collagen production in fibroblasts cultrued from normal and phenytoin-induced hyperplastic human gingiva.JPeriodontal Res1988，23:118～121
2 李茂深编. 生物化学. 人民卫生出版社，1978，475～478
3 Sorsa T.Uitto V-J，Suomalainen K.Comparison of interstitial collagenese from human gingiva，Sulcular fluid and polymorphonuclear leukocytes. J Periodont Res 1988，23:386～393
4 李振甲，王仁芝主编. 激素放射免疫分析. 科学技术文献出版社，1985，14～15
5 Suomalainen K，Sorsa T，Saxen L,Collagenase activity in gingival crevicular fluid of patients with Juvenile periodontilis. Oral Microbiol Immunol 1991，6:24～29
[收稿：1998-10-12], http://www.100md.com